作者：普拉特泽生物链接：zhuanlan./p/来源：知乎著作权归作者所有。商业转载请联系作者获得授权，非商业转载请注明出处。首先我们在冻存的过程中要减少冰晶的形成，尤其是大冰晶的形成：缓慢冻存细胞，可使细胞内避免产生大的冰晶。那么我们该怎样冻存细胞呢？一、慢冻细胞1、常规程序：使用程序降温盒当温度在-25℃以上时，1-2℃/min。当温度在-25℃以下时，5-10℃/min。当温度达到-100℃时，可迅速转入液氮中。2、简易程序：冷冻管管口朝上，放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟下降1-2℃的速度，在40min内降至液氮表面过夜，次晨投入液氮中。3、传统程序：冷冻管置于4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h（或隔夜），液氮长期储存。二、低温保护剂常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。三、细胞冻存方法1、预先配制冻存液：冻存液比例多种，根据细胞的特性进行调整冻存液的比例：5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基础培养液；2、取对数生长期的细胞。无血清细胞冻存液成分分析。苏州内皮细胞冻存液公司
如果想要达到这样的目的，那么就需要细胞冷却液，这种东西怎样配置呢?下面就来具体的了解一下，细胞冻存液的配方是什么？(一)细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液;2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。3.去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;4.离心1000rpm，5min;5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的**终密度为5×106/ml～1×107/ml;6.将细胞分装入冻存管中，每管1～7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。space(二)细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀;3.离心，1000rpm，5min;4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度。南京冻存细胞冻存液说明书南京地区有哪些做无血清细胞冻存液的公司。
有些则不需要。降温盒须恢复室温后再使用。根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，**提升了便捷性。但是，并非所有细胞都适用于这种冻存液，使用前必须做冻存测试，没问题后再批量应用。操作步骤步骤1：从冰箱拿出无血清非程序冻存液，待用步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：弃上清，加入适量无血清非程序冻存液，重悬细胞步骤4：按照1~，拧紧管盖，做好标记步骤5：将冻存管直接移入-80℃冰箱中。
用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，1000rpm，5min；弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；次日更换一次培养液，继续培养。注意事项：取错细胞：拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）解决：（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。（2）拿细胞时戴手套！2.水浴时间太长：2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）解决：（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。（2）要是冬天，就选用保温盒。3.冰盒内时间太长：复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。4.失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定。一、细胞冻存液1.无血清细胞冻存液产品概述:一种即用型、无需程序降温的细胞冻存液,适用于哺乳动物低温保存。无需配制，使用简单，细胞复活率高。产品特点：(1)安全：无血清。无血清细胞冻存液的使用说明。
并上下振荡数次混匀。备注：为了尽量减少污染，未使用完的细胞冻存液**好冻回-20℃，反复冻融不影响使用效果。2.用细胞消化液将生长良好的细胞消化成单细胞，并用细胞计数器或血球计数板计数细胞浓度。备注：悬浮细胞不需要消化但仍需要细胞计数，不易消化成单细胞的各种293细胞等**好使用含有EDTA的胰酶进行消化。3.用低速离心沉淀细胞，弃去上清。备注：通常2000~3000rpm离心5~10min即可。4.用适量细胞冻存液重悬细胞。备注：细胞浓度可根据情况调整为1~5×106/ml，通常为3×106/ml左右。5.按每管1ml分装到细胞冻存管中。6.直接放入-70℃冰箱中冻存。备注：无需程序降温盒或从4℃到-20℃到-70℃冰箱的繁琐程序降温。。备注：对于不同细胞，使用本细胞冻存液也可在-70℃冰箱中保存数周甚至数月，但建议**好尽快转入液氮中保存。8.复苏方法同常规细胞冻存液。备注：对于大多数对DMSO不敏感的细胞，复苏时甚至传代前无需去除细胞冻存液，实际上本细胞冻存液中某些成分具有一定的促细胞生长特性。可见，Quick-Freezing-M无血清细胞冻存液相对于含血清细胞冻存液的优势有：1.即用型，无需现配，直接将细胞悬浮于冻存液中即可2.通用型。做无血清细胞冻存液的合作平台有哪些？浙江细胞复苏细胞冻存液哪家好
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使细胞冻结中冰晶形成减少，从而避免了由于冰晶形成对细胞中生命活性物质的一系列损伤。【1】细胞冻存时利用低温降低细胞代谢，使细胞处于停止生长的“休眠”状态，等需要使用的时候再进行复苏操作。细胞储存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若储存在-196℃的液氮环境中，理论上可以实现长期永存。02细胞冻存的常见方法细胞冻存和复苏的关键要点是慢冻快融。细胞冻存的效果主要与降温步骤、冻存保护液的使用、冻存温度、复温速率及用于冻存的细胞生长状态有关。【2】降温速率过快容易引起细胞内冰晶损伤，所以为防止细胞内结冰必须采用一个“慢”的降温过程，并使用冻存保护剂，即冻存液。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂。根据降温速度区分，细胞冻存可以分为程序降温冻存与非程序降温冻存。传统的冻存方法是将冷冻管置于4℃30分钟、-20℃30分钟、-80℃过夜再转液氮。这种冻存方法步骤多，而且需要遵守几个时间点，容易被遗忘，对于繁忙的实验人员而言不那么友好。而程序降温方法，采用降温速率-1℃～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。常规的程序降温冻存方法较为复杂、费时，需要仪器设备花费较高。苏州内皮细胞冻存液公司